Electroforesis bidimensional de campos pulsados en minicámaras para caracterizar los cromosomas de Cryptococcus neoformans: procedimiento bioinformático

Cryptococcus neoformans is a pathogenic yeast that causes meningoencephalitis, specially in AIDS patients. Epidemiological studies of clinical isolates have been encouraged due to the increase in its incidence for infection monitoring and control. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) is the most popular technique for microbial molecular subtyping with epidemiological purpose, because of its versatility and reproducibility, but the analysis of eukaryotic genomes, like C. neoformans, in a single PFGE experiment, does not reveal mutations that do not alter the chromosomes size. That is why the author proposes a two-dimensional PFGE methodology for the C. neoformans genome characterization. The present describes the bioinformatic procedure used to design and verify in silico the efficacy of such methodology. The resolution of the intact chromosomes was achieved in the first dimension (1D) after 9.3 h of electrophoresis in the CHEF minichamber, applying pulses between 30 and 90s. The chromosomal fingerprint was obtained in the second dimension (2D) after restrict the individual bands with Not I or Sfi I and then separate the fragments in the CHEF minichamber applying pulses between 1 and 15 s for 5 h. The proposed methodology reveals the genetic differences in the genome of C. neoformans strains that were invisible in 1D, in 14.3 h of electrophoresis (1D + 2D), in contrast with the 30-40 h that takes a PFGE in regular electrophoretic chambers. Such methodology could be applied for studying the genome of other unicellular eukaryotic species. Karen León-Arcia Dpto. Biología Molecular, Centro de Neurociencias de Cuba, Ave 25, esquina 158, Cubanacán, Playa, La Habana. [email protected] Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp.119-130, mayo-agosto, 2015. 120 INTRODUCCIÓN La cripotococosis es una infección provocada por la levadura Cryptococcus neoformans que puede desencadenar meningoencefalitis y afecta principalmente a individuos inmunodeprimidos o inmunocomprometidos. Desde la aparición del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), se ha producido un gran incremento en su incidencia, como una afección micótica oportunista. Esta situación ha demandado la investigación epidemiológica de aislamientos ambientales y clínicos. Al respecto se ha propuesto el establecimiento de redes de vigilancia epidemiológica con la participación de laboratorios de referencia que permitan su identificación y monitoreo. Para el estudio de la epidemiología del Cryptococcus neoformans se han aplicado varias técnicas de tipificación basadas en caracteres genéticos. En particular la Electroforesis de Campos Pulsados (ECP) ha resultado un método útil y técnicamente simple para determinar la relación clonal de cepas involucradas en eventos epidemiológicos. Sin embargo, el cariotipaje no evidencia los cambios en la secuencia de bases del ADN cromosomal que provocan diferencias de tamaño por debajo del 5-10 % . Por esa razón, se ha propuesto el análisis bidimensional del ADN de eucariotas mediante ECP (2D-ECP). La 2D-ECP consiste en la obtención del cariotipo electroforético del microorganismo (primera dimensión [1D]), la escisión del patrón de bandas y su aplicación en otro gel, el cual se somete a otra ECP (segunda dimensión [2D]) en condiciones de electroforesis diferentes a las de la 1D. Las moléculas del patrón de bandas 1D pueden ser digeridas o no con enzimas de restricción. El análisis bidimensional, a diferencia del que se realiza en una sola dimensión, ha permitido explorar mayores regiones del genoma de eucariotas y detectar variaciones en el tamaño de los cromosomas de estos organismos que no han sido detectadas en una única ECP. Además, la 2D-ECP, combinada con la restricción en el propio gel de las moléculas de ADN, ha facilitado el mapeo de genes en los cromosomas del parásito intracelular Encephalitozoon cuniculi y la construcción del mapa físico de cromosomas circulares en especies bacterianas como Micoplasma mobile, Pseudomonas aeruginosa PAO y Anabaena sp. Los procedimientos de 2D-ECP descritos requieren de largos tiempos de electroforesis y gran cantidad de reactivos porque usan los sistemas convencionales de ECP. A esto se adicionan los gastos de tiempo y reactivos que requiere la selección de las condiciones adecuadas de ECP para la obtención de patrones de bandas de ADN en la 1D y 2D, debido a que este proceso se realiza a través de ensayos de prueba y error. Lo cual quedaría resuelto con la utilización de la tecnología de ECP en minigeles (miniECP), que emplea cinco veces menos cantidad de reactivos químicos y reduce de cuatro a cinco veces los tiempos de electroforesis. El sistema de miniECP Guefast 06® cuenta con un simulador (PFGESimulator) basado en las ecuaciones que describen la migración de moléculas de ADN lineales en el CHEF (Contour Clamped Homogeneous Electric Field), que permite generar las condiciones de electroforesis en cámaras miniCHEF y simular los patrones de bandas de moléculas de ADN que se obtendrían. De esta manera se pueden seleccionar a priori las condiciones experimentales que mejor resuelvan los cariotipos electroforéticos y los macrofragmentos de restricción de los cromosomas individuales de C. neoformans, u otro organismo eucariota unicelular. De igual forma se podría seleccionar a priori, la enzima de restricción para generar dichos macrofragmentos de restricción de los cromosomas individuales (o la huella digital cromosomal) de estos organismos mediante 2D-miniECP. Dichas condiciones experimentales permitirán caracterizar de forma rápida el genoma de cepas de C. neoformans mediante 2D-miniECP, y pueden evidenciar la presencia de mutaciones puntuales o reordenamientos génicos en los cromosomas de este microorganismo. El objetivo de este trabajo es determinar in silico las condiciones de ECP en miniCHEF que permiten el análisis bidimensional del genoma de las cepas C. neoformans B3501A y JEC21 y las enzimas de restricción útiles para obtener la huella digital de cada uno de los cromosomas en la Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp.119-130, mayo-agosto, 2015. 121 segunda dimensión. Además, evaluar in silico la utilidad de la información obtenida en la segunda dimensión para comparar el genoma de cepas de Cryptococcus neoformans. MATERIALES Y MÉTODOS En este trabajo se describe el procedimiento bioinformático que permitió la selección de los regímenes de tiempos de pulsos que generan el cariotipo electroforético y la huella digital cromosomal de C. neoformans, así como la(s) enzima(s) de restricción que evidencien los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción del ADN cromosomal en la 2D. Moléculas de ADN utilizadas en las simulaciones Las secuencias de bases del ADN de las cepas Cryptococcus neoformans B3501A y JEC21 se obtuvieron del sitio web: http://www.ebi.ac.uk/genomes/eukaryota.html. Para obtener dichas secuencias se emplearon las herramientas de software del sistema operativo Windows 7. El tamaño de las moléculas de ADN correspondiente a cada uno de los cromosomas de estos microorganismos se utilizó para simular en computadora los patrones de bandas en la 1D. Por otra parte, para simular los patrones de bandas que se obtendrían en la 2D, se utilizó el tamaño de los macrofragmentos de restricción del ADN de los cromosomas individuales generados previamente por la digestión virtual de sus secuencias de bases con diferentes enzimas. Simulación de los patrones electroforéticos de ECP Los patrones electroforéticos que se obtendrían en la cámara miniCHEF se simularon utilizando el software PFGESimulator. Este software simula los patrones de bandas basándose en la ecuación que describe la migración del ADN lineal en CHEF, para lo cual dibuja un rectángulo de (largo x ancho) 256 x 339 píxeles (1 píxel = 0.02 cm) que representa un gel virtual. Dentro del rectángulo se representan 12 o 19 pocillos, según se seleccione, donde se aplicarían las muestras en una electroforesis real y debajo de cada pocillo, se dibuja el patrón de bandas virtual de las moléculas de ADN que se obtendría experimentalmente. Todas las simulaciones se realizaron asumiendo campos eléctricos de 10 V/cm, temperatura del tampón TBE 0.5 X (Tris 44.5 mM, ácido bórico 44.5 mM, EDTA 1 mM, pH 8.3) de 20 °C y gel de agarosa al 1.5 %. Se simularon los cariotipos electroforéticos (que se obtendrían en la 1D) formados por los cromosomas intactos y las huellas digitales cromosomales (que se obtendrían en la 2D) formados por los macrofragmentos de restricción de los cromosomas individuales contenidos en las bandas que en ambas cepas de C. neoformans migraron la misma distancia los patrones 1D (bandas comunes). Diseño in silico de las rampas de tp necesarias para separar las moléculas de ADN en cámaras miniCHEF. La predicción de los patrones de bandas Las condiciones electroforéticas iniciales, utilizadas para simular los patrones de bandas del ADN de las cepas de C. neoformans en la 1D y 2D, se estimaron a partir del cálculo de los tiempos de reorientación (tr) de las moléculas de ADN mediante las ecuaciones descritas por López-Cánovas y col. Estas ecuaciones describen las velocidades de migración (cm/s) durante y después de la reorientación (vr y vm, respectivamente), así como, tr (s) y la migración total de moléculas de ADN de cualquier tamaño sometidas a electroforesis en miniCHEF. Las ecuaciones descritas son: vr = 0.0207 [Q 1.1 E /(8L)]; (1) vm = 0.665 [Q 1.1 E /(8L)]; (2) tr = 0.134 (L / vr) ; (3) Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp.119-130, mayo-agosto, 2015. 122 Donde: Q carga neta (en statcoulomb) de la molécula de ADN y se calcula como 1e-•pb. e electrón () y pb la cantidad de pares de bases. L largo del contorno (en cm) de la molécula lineal de ADN, y se calcula como 0.34 nm•pb. E campo eléctrico (en statvolt/cm). η viscosidad de la disolución estabilizadora (en Poises). Esta última se calcula interpolando el valor de la temperatura del tampón TBE 0.5 X en un polinomio que describe la relación entre la viscosidad del agua y su temperatura en °C. Los regímenes de tp aplicados en las simulaciones consistieron en secuencias (rampas) de tp. La selección de los tp límites de las rampas que se aplicarían en las corridas in silico se realizó a partir de los valores de los tr de las moléculas de ADN de las cepas en estudio, calculados con las ecuaciones (1) y (3). El criterio que se empleó para seleccionar dichos límites fue que los tp de máxima y mínima duración debían poseer valores comprendidos dentro del rango 0.1 ≤ tr/tp ≤ 1.0, donde tr es el tiempo de reorientación de las moléculas de ADN de mayor y menor tamaño que se requerían separar. Los tp intermedios (tp2...tp[n-1]) se calcularon considerando que debían poseer valores cercanos a los tiempos de reorientación de las moléculas que se pretendían resolver. Las correspondientes cantidades de repeticiones (Np1, Np2...Npn) de cada tiempo de pulso (tp1, tp2...tpn) se estimaron con el software PFGESimulator fijando Np1= Np2 =...Npn y cambiando estos valores hasta obtener la resolución deseada en aproximadamente 5 ó 10 h de electroforesis. Las condiciones de tp y Np se suministraron como condiciones iniciales al simulador del PFGESimulator y se modificaron, paso a paso, siguiendo el procedimiento de prueba y error hasta que se obtuvieron patrones de bandas donde aparecían resueltas la mayor cantidad de moléculas de ADN. Selección de las enzimas de restricción para el análisis 2D-miniECP Las secuencias de bases del ADN de las cepas C. neoformans B3501A y JEC21 se analizaron mediante la aplicación de búsqueda de sitios de restricción con la ayuda del software PFGESimulator. Este software carga la secuencia de bases del ADN del genoma de cualquier organismo, identifica la posición de los sitios de restricción para todas las enzimas de restricción conocidas y brinda, como datos de salida, la cantidad y tamaño de los fragmentos de ADN generados con cada enzima de restricción. Se seleccionaron las enzimas de restricción que cortaran 60 veces, o menos, las secuencias de los cromosomas procesados y que al menos el 50% de los fragmentos generados fueran mayores de 20 kb. Determinación de la similitud entre las cepas de C. neoformans Las imágenes de los patrones virtuales del ADN de las cepas de C. neoformans B3501A y JEC21, obtenidos en la 2D, se sometieron a un análisis densitométrico mediante el software GuefastScan® (Neuronic SA, La Habana, Cuba). Las parejas de patrones de restricción del ADN de las bandas comunes en los cariotipos electroforéticos de las dos cepas, se compararon entre sí. Para dicha comparación se consideraron como bandas, todos los pixeles comprendidos en las regiones de los patrones virtuales donde existió baja resolución en los fragmentos de restricción. Se determinó la similitud entre todas las parejas de patrones de bandas de ADN obtenidos en la 2D para las dos cepas de C. neoformans, a través del cálculo del coeficiente de DICE y con la ayuda del GuefastScan®. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El procedimiento bioinformático que permitió la determinación de las condiciones experimentales para la rápida caracterización del genoma de cepas C. neoformans mediante 2D-miniECP, se realizó a partir del análisis de las secuencias disponibles en las bases de datos en internet de las Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp.119-130, mayo-agosto, 2015. 123 cepas B3501A y JEC21. El mismo comprendió la selección de las enzimas de restricción adecuadas para fragmentar los cromosomas individuales, así como, de los regímenes de tp para obtener el cariotipo electroforético en la 1D y la huella digital cromosomal en la 2D, a través de la simulación en computadora de los patrones de bandas que se obtendrían en miniCHEF al separar los cromosomas intactos y sus macrofragmentos de restricción. Simulación del análisis en la 1D del genoma de cepas de C. neoformans La simulación de una rampa de tp entre 90 y 30 s durante 9.3 h permitió resolver virtualmente las moléculas del ADN cromosomal intacto de las cepas B3501A y JEC21 en patrones con 10 y 12 bandas respectivamente, de un total de 14 cromosomas en ambas cepas (Fig. 1). La aplicación de esta rampa de tiempos de pulsos, garantizó la separación adecuada de los cromosomas intactos que poseían tamaños en un rango de tallas amplio (de 700 a 2300 kb; Fig. 1). Sin embargo, algunos de los cromosomas de la cepa B3501A comigraron en una única banda, como los cromosomas X y XI (1063 y 1086 kb); VI y VII (1414 y 1411 kb); I, II y III (2297, 2283 y 2079 kb), debido a que poseen tamaños que se diferencian en muy pocas kb (Fig. 1A). De forma semejante ocurrió con el patrón de la cepa JEC21, en el que comigraron los cromosomas VIII y IX (1178 y 1194 kb) y los cromosomas I y III (2300 y 2105 kb) (Fig. 1B). Estas parejas de moléculas no fue posible resolverlas bajo ninguna otra condición de tp (resultados no mostrados) porque, al diferir entre ellas en solo en unas pocas kb, sus tr (Tabla 1) y velocidades de migración son semejantes, lo cual hace muy difícil que puedan ser resueltas mediante ECP. Fig. 1: Cariotipos electroforéticos virtuales de las cepas de C. neoformans B3501A (A) y JEC21 (B) que se obtendrían en la cámara miniCHEF, bajo condiciones de campo eléctrico 10 V/cm, agarosa 1.5 %, temperatura del tampón 20 °C, TBE 0.5X, usando la rampa de tp(s)-Np: (90-45) (70-100) (40-120) (30-30): 9.3 h de electroforesis. La rampa de tp(s)-Np: (90-45) (70-100) (40-120) (30-30), permitió separar virtualmente la mayoría de los cromosomas de ambas cepas de C. neoformans en un tiempo de electroforesis de 9.3 h, tres veces menor que el descrito en la literatura, el cual oscila entre 30 a 40 horas. Esta disminución en el tiempo de electroforesis, con respecto a los protocolos utilizados hasta el momento, debe facilitar la obtención de los cariotipos electroforéticos de C. neoformans experimentalmente, a lo que se le adicionaría el ahorro en reactivos que implica el uso de la tecnología para realizar ECP en minigeles. Los cariotipos electroforéticos virtuales de las dos cepas estudiadas, muestran 6 bandas comunes que se señalan en la Fig. 1 con números arábigos, como resultado de que bajo esas condiciones de electroforesis ambas cepas contienen cromosomas que migran la misma distancia en el gel. Estas bandas comunes están formadas por cromosomas de tamaños semejantes (Fig. 1), los cuales solo podrían ser discriminados analizando Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp.119-130, mayo-agosto, 2015. 124 la secuencia de bases del ADN. Para diferenciar estas moléculas indistinguibles en la 1D, proponemos un análisis bidimensional, que permita obtener la huella digital cromosomal, después de digerir los cromosomas individualmente con enzimas de restricción adecuadas para generar macrofragmentos que puedan ser comparados al separarlos mediante una segunda ECP. Las enzimas de restricción que evidencian polimorfismos de los fragmentos de restricción de los cromosomas que migran igual en los cariotipos de las cepas C. neoformans B3501A y JEC21 Para simular el análisis en la 2D del genoma de C. neoformans se determinó cuáles enzimas de restricción son útiles para obtener la huella digital de los cromosomas individuales, involucrados en las bandas comunes de los cariotipos electroforéticos de las cepas B3501A y JEC21. Este análisis permitiría detectar las diferencias en la longitud de los fragmentos de restricción, como indicativo de las diferencias en la secuencia de bases de moléculas de tamaños semejantes en ambas cepas. Las enzimas Asc I, Fse I, Not I, Pac I y Sfi I generaron virtualmente menos de 60 fragmentos de los cromosomas I, II, III, IV, V, VIII, X, XI y XIV de las dos cepas de C. neoformans y más de la mitad de dichos fragmentos poseían tamaños mayores de 20 kb (Tabla 1). Con excepción del ADN del cromosoma XIV de la cepa B3501A, en el cual la enzima Pme I no posee sitios de restricción, el resto de los cromosomas involucrados en las bandas comunes se digirieron virtualmente con Pme I de forma semejante a como lo hicieron las enzimas mencionadas anteriormente. La mayoría de los fragmentos de restricción de los cromosomas analizados con las seis enzimas tenían tamaños diferentes al comparar ambas cepas, que oscilaron entre 20 y 600 kb (Tabla 1). Sin embargo, el ADN del cromosoma II brindó fragmentos de hasta 1000 kb cuando se digirió virtualmente con cualesquiera de las enzimas preseleccionadas (Tabla 1, fila 2). La enzima Asc I también generó fragmentos con tamaños en el orden de las 700 kb del ADN de los cromosomas I y X (Tabla 1, filas 1 y 3), mientras que Pme I digirió el ADN de los cromosomas III y XIV (cepa JEC21) en fragmentos con tamaños de hasta 700 y 800 kb, respectivamente (Tabla 1, filas 3 y 5). Todas las enzimas preseleccionadas mediante el análisis in silico permitieron detectar diferencias entre las dos cepas en cuanto al tamaño y la cantidad de los fragmentos de restricción generados por ellas. El tamaño de los fragmentos de algunos cromosomas fue hasta tres veces superior en una cepa en relación con la otra, por ejemplo, el tamaño del fragmento mayor del cromosoma II generado con Pac I fue de 928 kb en la cepa B3501A y de 290 kb en la cepa JEC21, ya que el ADN de esta última poseía un sitio más de corte (Tabla 1, fila 2). La cantidad de fragmentos de un cromosoma con la misma enzima varió desde 1 hasta 6 en una cepa en relación con la otra, como en el caso del ADN del cromosoma III de la cepa B3501A, que con la enzima Not I se restringe en 36 fragmentos, mientras que en la cepa JEC21 en 42 fragmentos (Tabla 1, fila 3). Sin embargo, en este caso el tamaño de los fragmentos fue semejante. Estos resultados sugieren que si se resolvieran los fragmentos generados por cualquiera de estas seis enzimas preseleccionadas, en forma de patrones de bandas mediante miniCHEF, sería posible evidenciar los polimorfismos de los fragmentos de restricción de los cromosomas de tamaños semejantes en las capas B3501A y JEC21 de C. neoformans. Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp.119-130, mayo-agosto, 2015. 125 Tabla 1. Enzimas que generan hasta 60 fragmentos y que al menos el 50 % de ellos tienen tallas mayores que 20 kb al digerir virtualmente cada uno de los cromosomas de las cepas de C. neoformans B3501A y JEC21 involucrados en las bandas comunes de sus cariotipos electroforéticos B3501A JEC21 B3501A JEC21 Enz. Crom. Bandas > 20kb/ Total Intervalo tallas (kb) Bandas > 20kb/ Total Intervalo tallas (kb) Crom. Bandas > 20kb/ Total Interval o tallas (kb) Bandas > 20kb/ Total Intervalo tallas (kb) Asc I 14/17 4-685 14/17 4-683 5/6 17-363 7/7 69-258 Fse I 16/21 1-517 17/22 1-517 6/8 0-518 9/10 0.9-233 Not I I 24/29 0.5-374 26/29 0.5-375 VIII 11/17 4-334 10/12 5-257 Pac I 30/50 0-254 32/53 0-173 13/14 12-166 11/16 0-242 Pme I 16/18 4-375 17/18 4-375 9/9 28-334 9/10 4-319 Sfi I 26/37 0-268 26/34 0-266 11/14 0-424 8/9 2-355 Asc I 5/5 105-910 5/5 105-738 5/6 17-363 Fse I 8/8 19-769 8/8 19-711 6/8 0-523 Not I II 14/16 2-1078 14/17 2-435 IX 9/15 4-184 Pac I 17/24 3-927 18/25 3-290 14/16 0-141 Pme I 14/16 15-838 13/15 15-416 9/9 28-340 Sfi I 15/20 0-805 17/23 0-467 11/15 0-421 Asc I 14/14 28-254 14/15 3-288 5/6 10-430 4/5 10-781 Fse I 16/21 1-391 15/20 1-391 10/11 7-451 10/11 7-451 Not I III 28/36 0-338 31/42 0.3-201 X 10/14 0.2-195 12/17 0.2-186 Pac I 28/36 0-259 28/37 0-256 10/18 0-270 10/18 0-270 Pme I 9/11 0-854 9/11 0.4-886 8/8 27-351 8/8 21-354 Sfi I 19/26 0-307 21/28 0-248 7/10 0-307 8/11 0-308 Asc I 11/14 4-392 9/11 3-302 Fse I 11/17 0.2-261 9/11 5-198 Not I IV 16/20 5-317 XI 9/13 1-236 Pac I 25/34 0-145 13/16 1-202 Pme I 8/9 12-503 4/5 0.4-403 Sfi I 16/23 0.2-440 9/15 0.7-342 Asc I 11/12 0.7-410 10/10 22-442 3/3 67-568 3/3 67-564 Fse I 6/8 4-526 6/8 4-527 2/2 157-609 2/2 157-604 Not I V 17/22 0.4-195 20/24 0.4-195 XIV 8/10 6-285 8/10 6-291 Pac I 9/11 0.9-335 10/15 1-331 3/3 133-423 3/4 13-405 Pme I 11/12 6-335 11/12 6-367 – – 2/2 27-735 Sfi I 15/18 5-221 17/20 5-231 9/16 0.3-208 10/16 0.3-175 Obtención in sílico de la huella digital de los cromosomas individuales de las cepas C. neoformans B3501A y JEC21 en la 2D Las condiciones para separar los fragmentos de restricción de los cromosomas individuales en el miniCHEF se determinaron siguiendo el mismo procedimiento de selección de los tp, que el empleado para separar los cromosomas intactos en la 1D. La simulación de la separación de los fragmentos de restricción generados con las enzimas Asc I, Fse I y Pme I en los cromosomas I, II, III, IV, V, VIII, X, XI y XIV, que se obtendrían en la cámara miniCHEF aplicando la rampa de tp(s), Np: (15, 100) (10, 150) (5, 300) (3, 500) (1, 3000), reveló que en esas condiciones era posible resolver más del 80 % de los fragmentos mayores de 20 kb (Fig. 2). De forma similar, los patrones de bandas virtuales de los fragmentos de restricción de los cromosomas IV, V, VIII, X, Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp.119-130, mayo-agosto, 2015. 126 XI y XIV generados con Not I, Pac I o Sfi I también poseían la mayoría de las bandas bien resueltas en las condiciones de electroforesis mencionadas (Fig. 2). Sin embargo, los patrones de los cromosomas I de ambas cepas, con las enzimas Not I, Pac I o Sfi I poseían múltiples zonas de barrido, en las que comigraron fragmentos de tallas semejantes (Fig. 2, “[“). Los patrones de restricción de los cromosomas III, de ambas cepas, con las enzimas Not I y Pac I también presentaron numerosas zonas de barrido (Fig. 2, “[“). A pesar de la presencia de las zonas de barrido se pudieron evidenciar diferencias en la longitud de los macrofragmentos de restricción en los cromosomas homólogos de ambas cepas de C. neoformans (Fig. 2). Las enzimas Asc I, Fse I, Pac I y Pme I revelaron polimorfismos de los fragmentos de restricción de al menos tres de las siete parejas de cromosomas homólogos analizados (Fig. 2), mientras que Not I y Sfi I, los evidenciaron en todas las parejas analizadas (Fig. 2). Así, estas dos enzimas revelaron la mayor cantidad de diferencias en la secuencia de ADN del genoma de las dos cepas de C. neoformans, las cuales no pudieron ser detectadas en el cariotipo electroforético obtenido en la 1D. Fig. 2. Huella digital de los cromosomas I, II, III, V, VIII, X y XIV de las cepas de C. neoformans B3501A (A) y JEC21 (B), generadas virtualmente por la restricción con Asc I, Fse I y Pme I, Not I, Pac I y Sfi I, y por la separación de los fragmentos en miniCHEF con la rampa de tp (s), Np: (15, 100) (10, 150) (5, 300) (3, 500) (1, 3000), en gel de agarosa 1,5 %, 10 V/cm y TBE 0.5X a 20 °C. Por tanto, las condiciones experimentales recomendadas para generar la huella digital de los cromosomas de C. neoformans B3501A y JEC21 y evidenciar las diferencias entre ellos consiste en la restricción de los cromosomas individuales con Not I o Sfi I y la obtención de los patrones de restricción en la cámara miniCHEF bajo condiciones de campo eléctrico 10 V/cm, temperatura de la disolución estabilizadora 20 °C, TBE 0.5X y la rampa de tp(s), Np: (15, 100) (10, 150) (5, 300) (3, 500) (1, 3000). Estas condiciones permitieron revelar la información enmascarada en el cariotipo electroforético de las dos cepas de C. neoformans analizadas Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp.119-130, mayo-agosto, 2015. 127 Evaluación in silico de la utilidad de la información revelada en la segunda dimensión para discriminar cepas de C. neoformans Para simular el análisis en la segunda dimensión del genoma de C. neoformans se tuvo en cuenta que en las bandas comunes 2, 3 y 6 (Fig. 1) de los cariotipos electroforéticos de las cepas analizadas, comigraron más de un cromosoma en una o ambas cepas y que en la banda común 5 migraron la misma distancia en el gel, cromosomas no homólogos de las dos cepas (Fig. 1). Esto implica que si el análisis en la segunda dimensión se realizara experimentalmente habría que tener en cuenta a todas las moléculas de ADN que comigran en una banda, la cual se la denominaría banda mixta, porque contendría más de un cromosoma. Por lo tanto, en la digestión virtual con Not I o Sfi I de cada una de las bandas mixtas de los patrones se debió contemplar el análisis de restricción de todos los cromosomas contenidos en dichas bandas. En todas las parejas de patrones de bandas obtenidos por la digestión virtual, tanto con Not I como con Sfi I, de las moléculas de ADN que migraron en las seis bandas comunes, se observó polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción, lo que evidenció las diferencias en la secuencia de ADN que no pudieron ser detectadas cuando se compararon los cariotipos electroforéticos de ambas cepas de C. neoformans (Fig. 3). Por ejemplo, el análisis de la banda común 1 resultó en la comparación de los patrones de restricción del cromosoma XIV de cada cepa y evidenció que solo se diferenciaban en una banda (Fig. 3). Sin embargo, las diferencias entre los cromosomas XIV de ambas cepas fueron más evidentes cuando se obtuvo el patrón de restricción virtual con Sfi I, el cual mostró tres bandas diferentes entre los dos patrones (Fig. 3). En el caso de la banda común 4, que posee cromosomas homólogos en los cariotipos de ambas cepas (cromosoma V), con la enzima Not I se evidenciaron mejor las diferencias entre los patrones de restricción de ese par de moléculas, ya que estos patrones poseían 8 bandas diferentes, mientras que con Sfi I solo presentaban 4. Fig. 3. Comparación de los patrones de bandas virtuales de las cepas C. neoformans B3501A (A) y JEC21 (B), obtenidos en la 2D en miniCHEF, agarosa 1,5 %, 10 V/cm, TBE 0,5X a 20 °C y la rampa de tp (s), Np: (15, 100) (10, 150) (5, 300) (3, 500) (1, 3000), luego de la digestión in sílico con Not I y Sfi I de los cromosomas que migraron la misma distancia en sus cariotipos electroforéticos (bandas comunes). Las parejas de patrones de restricción comparados se formaron por la digestión enzimática de: cromosoma XIX de B3501A y cromosoma XIV de JEC21 (1), cromosomas X y XI de B3501A y cromosoma X de JEC21 (2), cromosoma VIII de B3501A y cromosomas VIII y IX de JEC21 (3), cromosoma V de B3501A y cromosoma V de JEC21 (4), cromosoma IV de B3501A y cromosoma II de JEC21 (5) y cromosomas I, II y III de B3501A y cromosomas I y III de JEC21 (6). Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp.119-130, mayo-agosto, 2015. 128 La restricción con Not I o Sfi I de la banda común 2 de la cepa B3501A resultó en un patrón de bandas que combinó los fragmentos de restricción del cromosoma X y el XI, pues se trata de una banda mixta en el cariotipo de esta cepa, el cual se comparó con el patrón de bandas resultante de la digestión del cromosoma X de la cepa JEC21. En consecuencia, los patrones obtenidos poseían diferente forma y cantidad de bandas. La cantidad de bandas diferentes fue de 7 y 8 bandas para Not I y Sfi I, respectivamente, lo cual es explicable porque se compararon los patrones de restricción de dos cromosomas de la cepa B3501A con uno solo en el cariotipo de la cepa JEC21 (Fig. 3). Un resultado semejante al anterior se obtuvo al comparar los patrones de restricción de las bandas comunes 3 y 6, las cuales también involucraban bandas mixtas, que contenían cromosomas homólogos y no homólogos (Fig. 3). Esta comparación evidenció una cantidad similar de bandas diferentes tanto con Not I (11 y 9 bandas, respectivamente) como con Sfi I (10 y 9 bandas, respectivamente) (Fig. 3). Por último, la pareja de patrones generados por Not I de las cepas B3501A y JEC21, correspondientes a la banda común 5 mostró 21 bandas diferentes (Fig. 3), lo que evidenció la gran diferencia que existía entre ellos. Estas diferencias se deben a que los cromosomas involucrados en la banda común 5 no son homólogos para ambas cepas (cromosomas IV y II), lo que explicaría que existieran variaciones en la secuencia de bases de dichas moléculas, aun cuando posean el mismo tamaño. El análisis de la similitud entre los patrones de restricción con Not I o Sfi I de las moléculas contenidas en las bandas comunes del cariotipo electroforético de ambas cepas de C. neoformans, mediante el cálculo del coeficiente de DICE, puso en evidencia las diferencias entre ellas (Tabla 2). La presencia de cromosomas homólogos en las bandas comunes arrojó la mayor similitud entre los patrones (bandas comunes 1 y 4, Fig. 3, Tabla 2). Cuando en una banda común existía más de un cromosoma, es decir, era una banda mixta en el cariotipo de una de las dos cepas, el coeficiente de similitud entre los patrones virtuales disminuyó porque uno de los patrones contenía además los fragmentos de restricción de otro cromosoma (bandas comunes 2, 3 y 6, Fig. 3, Tabla 2). Los valores de coeficientes de similitud de DICE menores se obtuvieron cuando las bandas comunes en los cariotipos electroforéticos de las dos cepas estaban formadas por cromosomas no homólogos (banda común 5, Fig. 3, Tabla 2). Tabla 2. Coeficiente de DICE para cada pareja de patrones de restricción virtuales con Not I o Sfi I de las moléculas contenidas en las bandas comunes de los cariotipos electroforéticos de las cepas C. neoformans B3501A y JEC21. Banda común Coeficiente de DICE